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    豬藍耳病病毒RT-PCR 檢測試劑盒

    產品詳細描述

    豬藍耳病毒RT-PCR 檢測試劑盒,采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR )技術檢測豬血清和組織中的PRRSV,適用于PRRSV的檢測、診斷和流行病學調查。

    【原理】
          利用吸附柱提取RNA作為模板,在反轉錄酶的作用下,以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA鏈;然后在DNA 聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環,使特異DNA 片段的拷貝數放大數百萬倍。將擴增的DNA 片段進行電泳、染色后,在紫外燈下,肉眼可見DNA 片段的擴增帶。
    【試劑盒組份】


    1. 生理鹽水
    20mL
    8. 吸附柱和收集管
    10
    2. 裂解液
    6mL
    9. 0.2 mL 薄壁PCR 
    15
    3. 洗滌液A
    7mL
    10. RT-PCR 反應液A
    180μL
    4. 洗滌液B
    7mL
    11. RT-PCR 反應液B
    50μL
    5. 洗脫液
    500μL
    12. 50 TAE 電泳緩沖液
    20mL
    6. 陰性對照
    300μL
    13. 染色液
    10μL
    7. 陽性對照
    300μL
     
     


    注:塑料袋內試劑(陽性對照、RT-PCR反應液AB)-20 凍存,裂解液2-8冷藏,其他室溫保存。
    【操作方法】
    一、樣品制備
    1樣品采集:病死或撲殺的豬,取肺、扁桃體和腦等組織;待檢活豬,用注射器取血5 mL,2保存。(要求送檢病料新鮮,嚴禁反復凍融。)
    2樣品處理:
    2.1 組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物;然后將樣品轉至1.5 mL滅菌離心管中,8000 rpm離心2 min,取100 μL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。
    2.2 全血樣品的處理:待血凝后取100 μL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。
    2.3 陽性對照的處理:取陽性對照 100 μL1.5 mL 滅菌離心管中。
    2.4 陰性對照的處理:取陰性對照100 μL1.5 mL 滅菌離心管中。
    二、病毒RNA的提取
    1. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入450μL裂解液,充分顛倒混勻,室溫靜置3min 。
    2. 加入275μL無水乙醇,輕輕混勻。
    3. 將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質,以免離心時堵塞吸附柱),10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
    4. 向吸附柱中加入500μL洗滌液A,10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
    5. 向吸附柱中加入500μL洗滌液B,10,000 rpm 離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。
    6. 空柱10,000 rpm 離心2 min。
    7. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中,在膜中央加入30μL洗脫液,室溫靜置2min,10,000 rpm 離心1min,獲得總RNA。
    三、RT-PCR
    1. 反應體系:分別取14μL RT-PCR反應液A(用前混勻)、4μL RT-PCR反應液B(用前混勻)和2μL模板RNA,混勻。
    2. 反應程序:在PCR儀上運行以下程序:42  45 min,94  3 min ;94  30 s 、53 30 s 、72  30 s,35個循環;72 延伸10 min。
    四、電泳
    1. 制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
    2. 電泳:待膠凝固后,取5μL PCR擴增產物點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液中電泳。
    3. 染色:取50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液30mL,加入10μL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結果。
    【結果判斷】
           陽性對照出現494bp擴增帶,陰性對照無帶出現(引物帶除外)時,實驗結果成立。被檢樣品出現494bp擴增帶為豬藍耳病毒陽性,否則為陰性。
    【需用但未提供的材料】
          組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經焦碳酸二乙酯(DEPC )處理的滅菌1.5mL 離心管和吸頭(10 μL、200μL、1000 μL)。
    【注意事項】
    1.本試劑盒有效期為6個月,不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的組分不要混用。
    2.所有試劑應在規定的溫度儲存,使用時拿到室溫下,使用后立即放回。
    3.注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內試劑瞬離15s,使液體全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
    4.嚴格按試劑盒說明書操作可以獲得最好的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
    5RNA提取過程中,應戴口罩、勤換手套,盡量縮短操作時間。
    6.所有接觸病料的物品均應合理處理,以免污染實驗室。
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